Mètode d'investigació de genètica molecular

Per explorar i identificar variants en l'estructura de l'ADN mètode genètic molecular usat. Per a cada regió d'ADN, que explora aquesta regió del cromosoma, gen o al·lel, els mètodes difereixen. Subjacent a cada mètode de genètica molecular comprèn alguns o altra manipulació d'ARN i ADN. Tots aquests mètodes es caracteritzen per una enorme complexitat, sense condicions de laboratori no poden ser dutes a terme, i el personal han d'estar altament qualificats. Aquest treball es porta a terme en diverses etapes.

etapes

En primer lloc, les mostres d'ARN o d'ADN per ser produïts. Aquí, un mètode genètic molecular es pot aplicar a pràcticament qualsevol material: una gota de sang, els leucòcits, fibroblasts cultura, mucosa (raspat), fins i tot els fol.licles del pèl, - ADN pot obtenir-se de qualsevol mostra. És adequat per a utilitzar qualsevol dels mètodes de genètica molecular i les seves diverses opcions i han llarg aïllat d'ADN s'emmagatzema congelat. La segona etapa està dedicada a l'acumulació dels fragments desitjats (amplificació) d'ADN, ja que ajuda a assegurar la reacció en cadena de la polimerasa in vitro (in vitro sense la participació d'un organisme viu). Com a resultat, els seleccionats es multiplica fragment d'ADN mitjançant aquesta reacció en cadena, i augmenta la quantitat d'ADN literalment milions de vegades.

El tercer pas en els mètodes d'investigació genètica molecular se suposa restricció multiplicada ADN (aquesta fragmentació, esquinç o tall). Restricció va realitzar per electroforesi en un gel de poliacrilamida o agarosa. Aquest mètode genètic-molecular d'estudiar el fragment d'ADN que permet que cadascú per prendre una certa posició en el gel. A continuació, el gel es tracta amb bromur d'etidi, capaç d'unir-se a l'ADN, la irradiació amb llum ultraviolada, llavors és possible observar parts de luminescència. els mètodes de diagnòstic de genètica molecular són variades i nombroses, però els dos primers passos són comuns a tots. Però per tal d'identificar fragments d'ADN, el gel pot ser acolorit, i molts altres mètodes existents.

espècies

Els mètodes més directes i generalitzades per micobacteris detecció poden incloure el mètode d'aprenentatge d'ADN genètica molecular anteriorment. La seva essència és que, per tal d'identificar el material cadena d'exploració de fragments específics de DNA de patògens. tècniques de diagnòstic de genètica molecular encara no tenen una forma més eficient per reconèixer malalties com ara la tuberculosi. Utilitzant la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), es pot estar segur que l'ADN original s'incrementarà el nombre de còpies en un milió de vegades, és a dir, no serà l'amplificació, i es mostrarà els resultats. El nivell de sensibilitat és molt alta - més del noranta-cinc per cent, que és el principal avantatge d'aquest mètode.

La resta dels mètodes de genètica molecular de la investigació sobre l'eficàcia de rendiment de múltiples còpies literalment es va duplicar, ja que en aquest cas la mostra de redacció mostra una seqüència de oligonucleòtid específica augmentar a cent sis vegades. Fins i tot el diagnòstic cultura de la tuberculosi del sistema respiratori inferior significativament la seva sensibilitat. Aquesta és la raó per la medicina moderna es basa en mètodes genètics moleculars de diagnòstic de la tuberculosi. Un mètode descrit és eficaç, especialment quan es tracta d'agents patògens d'alta variabilitat antigènica, determinar que d'altra manera és molt més difícil - requereix especials mitjans de cultiu i conrear molt de temps. mètodes genètics bioquímics i moleculars produeixen efecte molt diferent en els resultats.

diagnòstic de la tuberculosi

Marshall PCR diagnòstic de la tuberculosi més comunament usant aquelles seqüències d'ADN que són específics per als quatre tipus de la malaltia. Per aconseguir aquest objectiu sovint utilitzar encebadors que detecten seqüència d'elements IS (IS-986, IS-6110), ja que aquests elements caracteritzen espècies altament migratòries Mycobacterium tuberculosi i sempre presenten múltiples còpies en el genoma. També l'extracció d'ADN es pot dur a terme a partir de cultius purs i Clínica (esput dels pacients) per qualsevol altre mètode adequat. Per exemple, el mètode de Boom allà on s'utilitza el tampó de lisi basat en el tiocianat de guanidina i sílice com l'ADN portador. El nombre de pacients que difereixen pobres bacteriològica augmenta cada any, i per tant en la pràctica clínica ha establert un nivell completament diferent d'organització: mètode genètic-molecular d'estudiar l'ADN ha estat jugant un paper important en el diagnòstic.

No obstant això, cal admetre que no està exempt d'inconvenients. El mètode de PCR és l'ús de la freqüència porta un gran nombre de resultats falsos positius, i la raó és no només errors tècnics, sinó també les característiques del mètode en si. A més, l'ús d'aquest mètode de diagnòstic per determinar la viabilitat dels micobacteris, que han estat identificades, és senzillament impossible. No obstant això, aquest desavantatge no és el més important. mètodes genètics moleculars de diagnòstic de PCR impliquen el risc de contaminació d'ADN micobacteriano. Els requisits de certificació per aquesta raó que per als laboratoris de PCR dissenyat exclusivament dur, es requereixen tres locals separats. La tecnologia PCR és modern i molt complexa, que requereix l'ús d'equip adequat i personal altament capacitat.

bacterioscopia

Quan els resultats de la diagnosi de les anàlisis s'han de comparar amb altres dades: examen clínic, la radiografia, la microscòpia de frotis, cultiu i fins i tot resposta a un tractament específic són molt importants. En aquesta sèrie, els estudis de PCR és només un dels components. Detectar el patogen en el diagnòstic precoç poden ser els mètodes més simples i ràpides - bacteriològics.

No s'utilitza un microscopi de llum (coloració Ziehl-Neelsen) i fluorescents (fluorocroms colorants). L'avantatge és la velocitat de frotis dels resultats. No obstant això, el seu inconvenient és considerada amb raó la capacitat limitada a causa de la baixa sensibilitat. No obstant això, aquest mètode es dóna recomanacions de l'OMS com el més econòmic i el sòl per detectar pacients amb tuberculosi. La detecció de mètode bacteriològic micobacteris té valor de predicció i estimat excreció quantitativament bacteriana. Molt més segura per tractar amb ell els mètodes d'investigació de genètica molecular de la tuberculosi.

cultures

Millor detecció de micobacteris reconèixer els estudis culturals. Sembra de material patològic es fa al mig d'ou: Mordovsky, Finn II, LJ, i similars. Els punts de referència de resistència dels micobacteris a medicaments i proves indirectes de l'eficàcia d'una sèrie de micobacteris i les seves colònies in vitro, si el mètode aplicat de la cultura d'investigació. Per augmentar el percentatge d'aïllament de la inoculació micobacteris de material patològic es porta a terme en múltiples entorns.

Satisfer les necessitats de nombrosos, incloent patògens subvenció i fluids cultural. Utilitzat en aquest sistema automatitzat, i el tipus de mesurament del creixement vants. Els cultius s'han de mantenir en incubació durant un màxim de set a vuit setmanes. En aquest moment el cultiu amb la falta de creixement pot ser considerat negatiu. La forma més eficaç per detectar Mycobacterium tuberculosi consideren mostres biològiques: conillets d'índies material d'infectar de diagnòstic, que són extremadament susceptibles a la TB.

algunes xifres

interessant camp d'estudi, que va ser obert pel diagnòstic de PCR va ser estudiar el M. tuberculosis - infecció latent. El concepte modern de la infecció per tuberculosi suggereix que de cada cent persones que van estar en contacte amb M. tuberculosis, noranta-bé pot estar infectat, però només deu d'ells són s'està desenvolupant la malaltia activa. Altres tenen la immunitat de TB, i perquè el noranta per cent dels casos la infecció roman latent. Detectar un patró que ha ajudat a un mètode genètic molecular.

Els genetistes diuen que el cinquanta-cinc per cent de les persones els cultius van ser negatius patològica de material, i el vuitanta per cent de les persones infectades per M. tuberculosi, però que flueix sense manifestacions radiològiques de la malaltia, PCR rebut respostes positives. És un mètode de diagnòstic genètic ajudat a identificar als pacients en risc pels estudis de PCR, amb els resultats de les seves anàlisis (microscòpia i cultiu) van ser negatius, i la infecció subclínica M. tuberculosis era present.

la investigació moderna

La Federació Russa i laboratoris bacteriològics utilitzen un mètode accelerat de les concentracions absolutes: activitat de la reductasa de nitrat de micobacteris assajades pel reactiu de Griess. centres Anti-TB utilitzar un mètode que permet determinar la resistència a fàrmacs. Aquesta sembra en mitjans líquids, on automatitzat radiomètrica i sistema de comptabilitat fluorescent creixement de micobacteris. Aquesta anàlisi es realitza de forma ràpida - fins a dues setmanes.

Actualment, s'estan desenvolupant nous mètodes: resistència als fàrmacs de micobacteris es mesura a nivell de genotip. Estudi dels mecanismes moleculars de gens de resistència i mostra la presència a micobacteris. Aquests gens estan associats amb la resistència a certs fàrmacs. Per exemple, els gens kasa, INHA, resistents a la isoniazida, el gen rpoB katG - gens d'ARN 16SP rifampicina i rpsL - estreptomicina, emb1 - a etambutol, Gyra - una fluoroquinolona i així successivament.

mutacions

El diagnòstic modern va augmentar significativament el mètode nivell genètic-molecular per a l'estudi d'ADN i es deixa portar a terme estudis a gran escala de mutacions en tot el seu espectre. Ara sabem que les mutacions més comuns en els 516, 526 i 531 codons del gen rpoB, i va identificar la resistència a diversos fàrmacs. Hi ha tot un seguit de mètodes per a la tipificació de micobacteris utilitzant no només els mètodes tradicionals - bioquímics, biològics i culturals, sinó també àmpliament utilitzat tècniques de genètica molecular moderna. Ja hi ha adequada i proporcionen el mètode diagnòstic correcte per a la detecció de malalties monogèniques. Es basen en estudis d'ADN en l'àrea exacta d'un gen particular. Això sol ser un procés complex, llarg i costós, però les dades que és proporcionada per l'anàlisi genètica molecular, és molt més precís i informatiu de les dades de tots els altres anàlisis.

Durant molt temps s'ha sabut que l'ADN no canvia durant tota la vida de l'organisme que està en qualsevol cèl·lules odnakova nucleado, i això fa que sigui possible prendre l'anàlisi d'absolutament totes les cèl·lules del cos, en qualsevol etapa de l'ontogènia. El gen danyat es pot detectar abans de l'aparició dels primers símptomes de la malaltia clínica a gran escala, així com en persones sanes heterozigòtics, però que tenen una mutació en el gen. mètodes de diagnòstic de malalties hereditàries de genètica molecular permeten revelar els seus (enfocament directe, ADN-diagnòstic), així com per analitzar la segregació de la malaltia en la família amb ADN marcador loci (polimorfismes genètics), que estan estretament vinculades amb un gen danyat (és a dir, l'enfocament indirecte d'ADN-diagnòstic). Directament o indirectament - qualsevol diagnòstic d'ADN es basa en els mètodes d'identificació d'una part estrictament definida de l'ADN humà.

mètodes directes

Els mètodes directes de diagnòstic d'ADN són quan es coneix la malaltia hereditària gen culpable, com és ben conegut, i els tipus de les seves mutacions. Per exemple, un mètodes directes adequats en un nombre de malalties. Aquest corea de Huntington (CTG extensió repeticions), fenilcetonúria (R408W), la fibrosi quística (delta F508, mutacions importants) i similars. El principal avantatge del mètode directe és una exactitud diagnòstica de propietat total, i no hi ha necessitat de fer una anàlisi d'ADN de la resta de la família. Si es troba una mutació en el gen corresponent, que permet aprovar exactament un diagnòstic de l'herència, la determinació del genotip per a la resta de la família carregat.

Un altre avantatge d'un diagnòstic directe es considera per identificar un portador heterozigot de males mutacions dels familiars i els pares que van morir de la malaltia. Això és especialment cert per a les malalties autosòmiques recessives. Desavantatges dels mètodes directes també estan disponibles. Per aplicar-les, el que necessita saber exactament localitzar el gen anormal, l'exó-intró estructura del seu espectre i les seves mutacions. No totes les malalties monogèniques avui han rebut aquesta informació. mètodes directes informativat no es pot considerar completa, perquè un i el mateix gen pot tenir un gran nombre de mutació patològica que causa el desenvolupament de malalties hereditàries.

mètodes indirectes

Els mètodes indirectes en el diagnòstic d'ADN s'utilitzen en absolut, en altres casos, si el gen danyat no s'identifica, però només cromosòmicament, o si el diagnòstic línia no va donar el resultat (és el cas, si l'organització molecular complex de gens o en gran mesura, si hi ha una gran quantitat mutacions patològiques). Els mètodes indirectes van realitzar anàlisi de segregació dels marcadors polimòrfics en la família al·lèlica. Els marcadors que es troben en la mateixa regió cromosòmica o locus està estretament lligada a la malaltia i representen delecions o insercions, substitucions puntuals, repeticions, i el seu polimorfisme és a causa de la diferent quantitat de cèl·lules en el bloc.

Més convenient per al diagnòstic considerat microsatèl·lits i polimorfismes minisatèl·lit indirectes, que estan àmpliament distribuïts en el genoma humà. el seu valor s'expressa en alt contingut d'informació, si el dany a la distància genètica entre el marcador i el gen no és massa gran. En l'últim cas, la precisió de l'estimació es determina en gran mesura la freqüència de recombinació entre el marcador polimòrfic i danys. mètodes de diagnòstic indirectes també proporcionen pas preliminar obligatori de les freqüències al·lèliques de la població d'estudi analitzats entre els pacients i portadors de mutacions, a més de la necessitat de determinar la probabilitat de recombinació de no equilibri i adherència marcadors i al·lels mutants.

altres mètodes

segments curts d'ARN o ADN, així com un sol gen visualitzats en estudi microscòpic no poden ser, per tant, per identificar mutacions necessàries per diagnòstic genètic molecular. Hi ha un "Projecte Genoma Humà", així com altres avenços en genètica molecular ampliat en gran mesura la possibilitat que el diagnòstic de malalties hereditàries - pre i postnatal. Aquests mètodes poden proporcionar la detecció primerenca i fer una poli- predicció i malalties monogèniques, el debut té lloc en l'edat adulta. Malauradament, a causa de les capacitats tècniques dels estudis de genètica molecular són de vegades més enllà dels límits ètics que s'estableixen en relació amb l'herència, sobretot quan el diagnòstic és en l'adolescència i la infantesa.

anomalies cromosòmiques estructurals i numèriques són les causes més comunes de la malaltia i el càncer, i moltes malformacions. Les aberracions cromosòmiques han de ser identificats, la qual cosa és important per a l'orientació familiar - per avaluar el pronòstic, juntament amb risc reproductiu en embarassos futurs. L'anàlisi cromosòmica és el "patró or" del diagnòstic genètic, però és limitada. Només els mètodes de anàlisi genètica molecular poden fer més, perquè no utilitza la clonació de marcadors fluorescents basat tecnologia capaç de la seva alta sensibilitat per identificar els canvis cromosòmics subtils que són impossibles de detectar clàssics estudis citogenètics. Aquestes tècniques s'estan expandint cada vegada més les nostres capacitats de diagnòstic, quan s'examina, els nens amb discapacitats del desenvolupament, retard mental, amb moltes altres malalties hereditàries.

troballes

És molt important per a la humanitat eren l'estructura del gen i la funció del coneixement, tipus de variabilitat, la capacitat de detectar malalties hereditàries que es van produir en relació amb el desenvolupament de la genètica molecular. seus mètodes estan dirigits a l'estudi de la molècula d'ADN - i quan és normal, i quan estigui danyat. Preparació de seqüències d'àcids desoxirribonucleicos de nucleòtids (ADN) s'estén a les etapes de rebre mostres per identificar fragments individuals. Aïllament de DNA genòmic a partir de les cèl·lules, de restricció (llagrimeig), amplificació (clonació), electroforesi dels fragments (que separa la seva càrrega elèctrica i pes molecular per electroforesi en gel d'agarosa). Identificació de fragments específics localitzats a la superfície d'una banda discreta.

Després d'entrar en els filtres especials acte, a través del qual passa cada hibridació fragment amb fragments d'ADN clonats o sondes radioactives sintètic és un control, que serà igual a cada mostra de prova. Si canvia la posició o la longitud en comparació amb la sonda, si un nou fragment o desaparegut - tot això suggereix que el gen analitzat ha estat objecte de la reestructuració en la seqüència de nucleòtids. Hi ha vuit tècniques bàsiques d'estudis de genètica molecular: de seqüenciació (Determinació de la seqüència d'ADN), reacció en cadena de la polimerasa (augment en el nombre de seqüències), la preparació d'encebadors coneguts gens, la clonació d'ADN, la producció de molècules recombinants derivades de proteïnes a causa de molècules recombinants, la creació d'un conjunt complet (col·lecció biblioteca) fragments que es van obtenir mitjançant l'ús de restricció clonat.