La microscòpia de fluorescència: principis del mètode

L'absorció i re-emissió de líquids inorgànics i orgànics més llum és el resultat de fosforescència o fluorescència. La diferència entre els fenòmens és la durada de l'interval entre l'absorció i l'emissió de flux de llum. Quan la fluorescència d'aquests processos es produeixen gairebé al mateix temps, mentre que la fosforescència - amb cert retard.

informació històrica

El 1852, el científic britànic Stokes, es descriu primer la fluorescència. Es va introduir un nou terme com a resultat dels experiments amb el espat fluor, que emeten llum vermella sota la llum ultraviolada. Stokes va observar un fenomen interessant. S'ha trobat que la longitud d'ona de la radiació fluorescent és sempre més gran que el flux de la llum d'excitació.

Per confirmar la hipòtesi al segle 19 hi ha hagut molts experiments. Ells van mostrar que una varietat de mostres de fluorescència sota la influència de la llum ultraviolada. Entre els materials, entre altres coses, vidres estat, resines, minerals, clorofil·la, drogues cru, compostos inorgànics, vitamines, olis. L'ús directe de colorants per a les proves biològiques començar només en 1930,

La microscòpia de fluorescència: Descripció

Alguns dels materials utilitzats en la primera meitat del segle 20 els estudis van mostrar una alta especificitat. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Gràcies a l'actuació, que no podria aconseguir mitjançant el contrast dels mètodes, el mètode de microscòpia de fluorescència s'ha convertit en una eina essencial en la investigació biomèdica i biològica. Igualment es van obtenir resultats importants, i per als materials.

? Quins avantatges del mètode de microscòpia de fluorescència? L'ús de nous materials ha fet possible i la selecció de components submicroscòpiques de cèl·lules altament específic. Microscòpia de fluorescència es pot detectar molècules individuals. Una varietat de colorants permet la identificació de diversos elements alhora. Tot i la resolució espacial limitació límit de difracció de l'equip, que, al seu torn, depèn de les propietats específiques de la mostra, la identificació de molècules per sota d'aquest nivell també és molt possible. Diverses mostres després de autofluorescència irradiació d'exposicions. Aquest fenomen és àmpliament utilitzat en la petrologia, la botànica, la indústria dels semiconductors.

característiques

Estudiar els teixits animals o patògens sovint complicats o massa febles o molt forts autofluorescència no específica. No obstant això, el valor en els estudis adquireix introducció en els components de material s'excita a una longitud d'ona específica i emissors de la intensitat de flux de llum necessària. Els fluorocroms actuen com colorants capaços de independentment units a les estructures (visibles o invisibles). Per tant tenen una alta selectivitat per a l'objectiu, i el rendiment quàntic.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. La microscòpia de fluorescència ha estat àmpliament utilitzat des de l'aparició dels tints naturals i sintètics. Posseïen certs perfils d'intensitat de l'emissió i excitació i dirigits a dianes biològiques específiques.

Identificació de molècules individuals

Sovint, en condicions ideals, es pot registrar una brillantor element separat. Per això, entre altres coses, cal proporcionar una prou baix soroll del detector i el fons òptic. molècula de fluoresceïna a fallades a causa del fotoblanqueo pot emetre fins a 300 mil. fotons. En eficiència de recol·lecció del 20% del procés i pot registrar-los en una quantitat d'al voltant de 60 mil.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Microscòpia de fluorescència basat en fotodíodes d'allau o multiplicació electrònica, va permetre als investigadors per observar el comportament de les molècules individuals a través de la segona, i en alguns casos fins i tot minuts.

complexitat

Una qüestió clau a favor de la supressió del soroll de fons òptic. A causa del fet que molts dels materials utilitzats en el disseny de filtres i lents d'exhibir algunes autofluorescència, els esforços dels científics en les primeres etapes van ser destinades a la producció de components que tenen una fluorescència baixa. No obstant això, experiments posteriors han donat lloc a noves conclusions. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. En particular, es va trobar que la microscòpia de fluorescència, basada en la reflexió interna total, que permet aconseguir un fons sota la llum d'excitació i d'alta intensitat.

mecanisme

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Els principis de la microscòpia de fluorescència, basats en la reflexió total interna és l'ús d'ones evanescents o evanescent. Es produeix en el límit entre els mitjans amb diferents índexs de refracció. En aquest cas, el feix de llum passa a través del prisma. Té un paràmetre d'índex de refracció alt.

El prisma adjacent a la solució aquosa o de vidre amb un baix paràmetre. Si un feix de llum dirigida-hi en un angle que és més crític, el feix es reflecteix totalment des de la interfície. Aquest fenomen, al seu torn, fa que les ones nonpropagating. En altres paraules, el camp electromagnètic generat que penetra en un medi amb un paràmetre d'índex de refracció inferior a una distància inferior a 200 nanòmetres.

L'ona evanescent intensitat de la llum seria suficient per excitar fluoròfors. No obstant això, per la seva extremadament petita profunditat, el seu volum serà molt petit. El resultat és un fons de baix nivell.

modificació

La microscòpia de fluorescència es basa en la reflexió interna total, es pot implementar amb epi-il·luminació. Això requereix lents amb alta obertura numèrica (almenys 1,4, però és desitjable que va aconseguir 1,45-1,6), i s'il·lumina parcialment aparell de camp. Això últim s'aconsegueix amb una mida de punt petit. Per a una major uniformitat usant un prim anell, que està bloquejada per una part del corrent. Per l'angle crític, després de la qual cosa hi ha una reflexió total, cal un alt nivell de refracció del medi d'immersió en la lent i la coberta de vidre del microscopi.